测量细胞内温度的新方法～无标记的“水分子”温度计～

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本文来自Chem-Station日文版細胞内の温度をあるがままの状態で測定する新手法の開発　～「水分子」を温度計に～spectol21

翻译投稿炸鸡校对 HaoHu

第266回焦点研究采访到了东北大学药学研究科中林实验室的研究生二年级的杉村俊紀同学。

中林实验室致力于利用光谱学从分子论角度理解细胞和生物体分子。迄今为止已经开发了以自制的激光显微镜为代表的多个独有的光谱技术。

今天介绍的内容是通过使用水分子作为温度计绘制出生物体内温度分布信息。本次的核心技术显微拉曼分光，是结合了扎实的分子理论和先进的分光技术的新型生物体分析手法。论文发表在Angew. Chem. Int. Ed.上，在东北大学官网上也可以找到相关信息。

“Label-Free Imaging of Intracellular Temperature by Using the O–H Stretching Raman Band of Water”
Toshiki Sugimura, Shinji Kajimoto, and Takakazu Nakabayashi*,Angew.Chem. Int. Ed.59, 7755-7760 (2020), DOI:10.1002/anie.201915846

指导教授中林孝和对杉村俊紀同学做了如下评价:

杉村同学是一位非常有干劲的学生。这次的研究有很多难关，我也曾经很多次怀疑到底会不会成功。然而，杉村同学依然没有放弃，在实验室低头苦干，改进了实验方案和分析方法，并且整理出了令人信服的研究成果。明年起，杉村俊紀同学将会步入企业工作，进入新的世界成为一个社会人。我坚信他在实验室中的经验以及在实验室中获得的研究能力将在新世界中充分发挥作用。我认为在不同领域都要能出成绩的很重要的一点就是要有暂时放下过去的辉煌，重新开始的心态。希望他今后能够保持谦逊，却仍不忘保持内心的自信，继续加油。

下面是杉村同学的采访。

Q1.您能给我们简单介绍下您这次的研究内容吗 ?

我这次开发了一种无标记测量单个细胞内部温度的新方法。我们大家现在每天都会通过测量自己的体温来判断自己的健康状态有无异常。体温和我们的健康状态有着密切的联系，而同理，温度和生物的最小单位——细胞的状态也有千丝万缕的联系。因为细胞内温度与细胞中发生的各种生命现象密切相关，所以细胞内温度被认为是了解细胞状态的重要参数。

近来，利用能发射随温度而变化的荧光的热敏荧光染料的方法作为测量细胞内温度的方法非常的火。然而，该方法需要预先用荧光色素将细胞染色，问题在于荧光色素进入细胞中细胞内部的环境会发生改变。此外荧光不光受温度影响还受其他参数影响（比如细胞内的粘度，极性，PH），测定结果也存在不准确的风险。在以上的背景下，我们急需要一种无标记就能准确测量细胞内温度的新方法。

于是我们把目光放在了细胞中本来就存在的水分子。我们很早就知道水分子之间的氢键的强度随温度的变化而变化₁。于是我当初的设想就是如果能捕捉到氢键的强度变化不就能推测出温度变化了吗。而且不需要染色，而正因为细胞内无处不在的水分子，我们并不担心测量的覆盖范围。同样显而易见的是，细胞质中水分子的浓度是如此之高，以至于它不太可能受到诸如pH和粘度之类的参数的影响。

为了测量水分子之间氢键的强度，我们使用了振动光谱之一的拉曼光谱。对得到的拉曼光谱图中表示水分子的氢原子和氧原子的O−H伸缩振动的条带绘制出O−H伸缩振动的强度与水温的标准曲线（图1）。由这个温度标准曲线图可以实际具体测量到随着药剂的添加细胞质内温度的增加量，并观测到升温情况（图2）。

图1.(a) 从细胞培养液（HBSS）得来的拉曼光谱中O−H伸缩振动的强度与温度的关系。O−H伸缩振动来自细胞培养液中的水分子；(b) (a)中各温度下的O−H伸缩振动强度与25 ºC下的O−H伸缩振动强度的差值；(c)各温度图谱下，3548 cm-1处的强度与3179 cm-1处的强度的比值与温度的关系曲线。结果表明，比值关于温度几乎呈线性变化，且可以作为标准曲线来使用。

图2. (a) 添加能够使细胞质中温度上升的FCCP(一种药剂）前后，细胞内的温度以及细胞周围的培养基温度的均值。所用的细胞来自宫颈癌细胞系的HeLa细胞；(b, c) FCCP添加前后单个HeLa细胞的温度图像；(d) 温度变化图像。通过从（c）的温度图像减去（b）的温度图像获得温度变化的图像。在对应于细胞质的区域中，观察到随着FCCP添加，细胞质区域温度出现升高现象。

Q2.能请您谈谈您觉得这个研究中最具有挑战性的地方和印象最深的地方吗？

和这次的细胞内温度测定一样，在生物化学和药物学领域的各类分析中使用最广泛的一直都是荧光光谱法，而拉曼光谱法的应用则相对较少。因此，我认为我们首先要想办法找出一个能突出拉曼光谱相对于荧光光谱法的优势的实验和分析体系（这次的分子内温测定实验）。

例如，未在本文中展示的用拉曼光谱可以测量细胞内温度并实时追踪细胞中药物分子。在调查FCCP在细胞中的分布情况时图二显示FCCP在细胞质中呈现高浓度浓缩状态。虽然荧光色素也可以测得细胞内温度和实时追踪药剂分子，但是需要使用多个荧光色素，需要分别研究激发波长和观测波长等实验条件。糟糕的是药剂分子被贴上了荧光标识，荧光标识有可能会影响药剂分子的形态，有可能导致无法追踪到药物分子。这次使用的拉曼光谱是观测分子振动的方法，因为不需要对待观测的分子进行标记，所以追踪药物分子和测量细胞内温度都可以进行。

Q3.您认为研究最困难的地方是哪里呢？您是怎么克服的呢？

得到图2所示的细胞温度图像费了好大一番功夫，在实验方法和解析方法上存在重重困难。为了得到同一细胞的药剂添加前后的拉曼光谱图，需要在显微镜下对细胞注射药剂，经常在高倍镜头下稍微移动下玻璃片的位置就再也找不到原来那个细胞了。为此我在显微镜下对着空培养皿反复练习注射操作，就像进行肌肉训练一样，让我的全身适应这样一种微小动作的状态。经过练习我能很好的控制手抖，终于可以在添加药物之前和之后测量同一细胞的拉曼图像了（笑）。

但是下一个挑战又出现了：如何消除拉曼光谱图上的杂质峰。使用拉曼光谱有个缺点：信号强度（即拉曼光强）很弱。在获得的拉曼光谱上出现许多杂质峰，无法估计准确的温度就无法获取细胞的温度图像。经过几个月的反复试验后，我想出了一种分析方法，就是将添加FCCP之前和之后细胞的所有拉曼成像数据汇总在一起进行统计分析。如此这样就能消去杂质峰的影响也不会消去与细胞温度有关的情报，就是这样我最终得到了细胞内的温度图像。