「Spotlight Research」酶促进羟胺的氮插入反应

热点研究

作者：石油醚

本期热点研究，我们邀请到了本文第一作者来自加州理工学院的Gao Shilong博士为我们分享。

2023年9月6日，JACS在线发表了来自加州理工学院Frances H. Arnold教授团队题为「Enzymatic Nitrogen Incorporation Using Hydroxylamine」的研究论文。本文中，作者发现了一种血红素酶ParPgb-HYA-5209，其可利用NH₂OH作为氨源，成功实现了苄基C-H胺化和苯乙烯氨基羟基化反应。机理研究揭示了一个逐步的自由基反应途径，其中C-H键断裂是决定速率的步骤。本文为制备含氮分子的可持续经济的生物催化途径开辟了新的道路。此外，作者提出了一种新的可能性，即发现利用NH₂OH作为胺源的天然酶。

“Enzymatic Nitrogen Incorporation Using Hydroxylamine.

Shilong Gao, Anuvab Das, Edwin Alfonzo, Kathleen M. Sicinski, Dominic Rieger, and Frances H. Arnold*J.Am. Chem. Soc.,2023,ASAP. Doi:10.1021/jacs.3c08053”

Q1.请对“Enzymatic Nitrogen Incorporation Using Hydroxylamine”作一个简单介绍。

此工作探讨了将羟胺（NH₂OH）用作酶催化氮引入的原料的可能性，这个过程对于生物催化和可持续化学有着重要的影响。该研究受自然界对生物分子功能化的启发，研究了依赖血红素的酶以及它们处理NH₂OH进行胺化反应的潜力。羟胺在其化学性质上与过氧化氢（H₂O₂）有一些相似之处，这表明它可能通过酶催化来实现氮引入。尽管羟胺在土壤微生物中自然存在，但以往并未被知道它可以用作生物合成中的胺源。论文介绍了一种经过改良的血红素酶ParPgb-HYA-5209的发现，它能够利用NH₂OH进行苄基C-H主胺化和苯乙烯氨基羟基化反应。定向进化进一步增强了酶的活性。机理研究揭示了一个逐步的自由基反应途径，其中C-H键断裂是决定速率的步骤。这篇论文的发现为制备含氮分子的可持续经济的生物催化途径开辟了新的道路。此外，我们提出了一种新的可能性，即发现利用NH₂OH作为胺源的天然酶。

Q2.有关本次研究的时候遇到过怎样的困难呢？又是怎样克服的呢

NH₂OH的反应性： NH₂OH相对于亲电性羟胺衍生试剂缺乏吸电子基团，导致N-O键解离能升高。这在寻找能够有效激活NH2OH进行氮引入的酶时构成了一道障碍。为了成功进行酶催化，关键是血红素酶必须选择性地结合NH₂OH中的氮，而不是氧，以形成反应中间体。实现这种选择性需要仔细考虑酶的活性位点。

在研究的初期阶段，几种血红素酶变体仅表现出微量产物形成的水平。这种有限的反应性对于确定进一步研究的有希望的候选者构成了重大挑战。得益于ParPgb的高稳定性，定向进化很快提高了酶的反应性。

优化反应条件：大肠杆菌中蛋白质表达和血红素产生之间的差异造成血红素占位仅约为25%。我们发现在蛋白质纯化过程中，使用外源的血红素b辅因子能重构完整的酶。最后，我们发现还原条件显著提高了纯化酶的反应性。

理解机制：解开利用NH₂OH进行苄基C-H主胺化的复杂机制是一项挑战。这需要进行动力学同位素效应（KIE）实验和自由基探针研究，这些研究提供了有价值的见解，但也增加了解释上的复杂性。未来对机理的研究工作会进一步揭示反应过程中可能涉及的中间体。

Q3.本次研究主体，有没有什么让您感觉特别辛苦和烧脑呢？

在选择进化的起始点时，我们刻意选择了反应性较低、但体积小稳定性高的酶。这一特性使其能够容忍有益但通常会使其不稳定的突变。得益于此，在第一轮定向进化中，我们发现了大量有益的突变。但与之伴随的挑战在于如何高效的重新组合这些突变。最终，我们采用了Stagger Extension Process的策略。在不加入新突变的前提下，三轮定向进化成功地从初始的41个突变中重排筛选出五个有益的突变，高效地提高了酶的反应性。

将复杂的科学概念翻译成一篇连贯且容易理解的叙述是一项挑战。研究涉及复杂的酶机制、自由基途径和动力学参数，这些对非专业读者来说可能不容易理解。在科学准确性和可读性之间保持平衡、在提供足够的细节以传达研究重要性的同时保持简洁也是一项微妙的任务。在写这篇论文时，我们希望读者能记住的是酶利用NH₂OH作为胺源的可能性。我们希望看到更多对NH₂OH在自然界中作用的探索。

Q4.将来想继续研究化学的哪个方向呢？

希望更深入地研究蛋白质工程，时刻关注该领域的最新发展，例如计算蛋白质设计、定向进化策略和高通量筛选方法。这些工具可以有助于有针对性地设计和优化酶，以用于特定的应用。探索在基因编辑领域中确定工程酶的具体应用。例如，探索工程酶如何提高基因编辑技术（如CRISPR-Cas9）的精确性、效率和安全性。研究在基因治疗和精准医学中的潜在治疗应用。希望与分子生物学、遗传学和生物技术等相关领域的专家进行合作。基因编辑是一个跨学科的工作，与专家合作可以提供宝贵的见解，并为跨学科研究提供机会。