本文作者：海猫

导读

近日，巴黎-萨克雷大学Ariane Deniset-Besseau教授课题组在分析化学杂志上发表论文，将原子力显微镜和红外激光（AFM-IR）结合使用，可以获取分辨率和灵敏度在10-100 nm之间的红外吸收光谱，可以用于标准的石蜡嵌入式肾脏活检。万古霉素铸型可能会在受损的肾小管中发现。与标准的红外光谱不同，AFMIR揭示了沉积物的异质性，并确定万古霉素与含磷酸盐的分子共沉淀。因此，该方法具有在纳米空间分辨的巨大潜力，对于药物导致的肾炎，纳米晶，局部脂质或碳水化合物变化的研究提供了新的方法。

Nanometric Chemical Speciation of Abnormal Deposits in Kidney Biopsy: Infrared-Nanospectroscopy Reveals Heterogeneities within Vancomycin Casts

Emmanuel Esteve, Yosu Luque, Jehan Waeytens, Dominique Bazin, Laurent Mesnard, Chantal Jouanneau, Pierre Ronco, Alexandre Dazzi, Michel Daudon, and Ariane Deniset-Besseau

Anal. Chem.ASAP DOI:10.1021/acs.analchem.0c00290

正文

1950年代，肾脏活检的普及是现代肾脏病学的第一步。现如今，活检已经成为诊断肾脏病变的重要标准。发展完备的标准技术可以精确诊断大多数肾小球疾病。然而，在许多肾小管间质性肾炎病例中，很难从组织学研究推断出肾脏侵袭的机制。在一些例如草酸中毒或药物诱发的肾炎，其特征是薄壁组织内存在异常沉积物。研究这些化合物的化学形态具有重要的病理生理学意义。

物理化学技术，如傅立叶变换红外（FTIR）或拉曼显微光谱仪，是通过光和物质的相互作用对物质进行化学作图而开发的。FTIR光谱是一种常见的非破坏性理化工具，可以收集红外吸收光谱，并将其集成到显微镜中来确定肾结石的化学相，并有助于描述肾脏活检中20多种类型的异常沉积物。2017年，使用μFTIR，作者确定了万古霉素暴露的急性肾损伤患者的肾小管中存在万古霉素铸型。然而，由于其空间分辨率低，无法充分研究亚微米级晶体或沉积物。

在这里，作者提出了一种创新的红外（IR）纳米光谱工具，称为AFMIR，以克服这一障碍。这项技术已广泛应用于聚合物科学和微生物学，最近已用于分析红细胞，骨骼和皮肤组织，可实现纳米级的化学识别。它的优势在于使用原子力显微镜（AFM）来感测红外吸收，而不是光谱显微镜中常用的经典光学设备。系统以接触方式获取形态图像。为了进行红外测量，用红外激光突出显示样品，发生的吸收现象导致AFM尖端检测到的样品快速膨胀（光热过程）。原子力显微镜所获取的信号与红外吸收率成正比。因此，可以获得超局域红外光谱以及红外地图。AFMIR光谱中，xy空间分辨率取决于AFM尖端半径（大约10 nm），沿z轴的灵敏度大约为100 nm。此外，除了它的纳米分辨率，AFMIR还可以提供样品的大图（90 μm），可用于探索人肾脏的各个部分。作者在万古霉素铸型肾病患者的标准石蜡嵌入的肾脏活检中，首次报道了使用这种非破坏性IR纳米光谱技术对异常沉积物的化学鉴定。

Figure 1．使用micro-FTIR的万古霉素铸型形态，全局蛋白质与万古霉素红外成像及红外谱图

万古霉素铸型是可以形成百纳米级球（Figure 1A）的肾小管内沉积物。使用亮场成像可以发现这些铸型（Figure 1B），以获取感兴趣区域的红外显微图，并辨别其中的化学成分（Figure 1C-E）。标准的蛋白质含量在1650 cm^-1附近具有很强的吸收能力，可以进行全局蛋白质作图（Figure 1C）。万古霉素可以与蛋白质区分开来，并且可以显示出酰胺II谱带的整体位移，因此可以单独作图（Figure 1D）。红外光谱包含所有细胞内成分的响应，信息很丰富。酰胺II带的吸收域在1600至1500 cm^-1范围内（主要是由于肽键的N-H键弯曲）。在正常组织中，该谱带通常位于1540 cm^-1左右（Figure 1E的蓝色光谱），而对于纯万古霉素，该谱带的中心在1505 cm^-1（Figure 1E万古霉素参考谱的黑色虚线）。并且仅富集万古霉素的光谱在1230 cm^-1和1060-1020 cm^-1附近显示出强吸收带。

沿着Figure 1C中的黄色箭头获得的光谱表明，万古霉素含量从低到高，在Figure 1E中由深蓝色到红色的梯度描绘。尽管红外显微技术比较特殊，但其空间分辨率受到衍射的限制。但即使大的万古霉素铸型也不会超过几微米。因此，不可能精确的探测沉积物的组织和组成。

而AFMIR系统配有标准的光学显微镜视图，可以进行标准的组织学鉴定。设备的AFM部分允许获取形态图像，与标准光学图像十分相似，甚至更接近于扫描电子显微镜（详见SI）。

Figure 2．使用AFM-IR的万古霉素铸型形态、红外成像及红外光谱

作者在肾脏活检中使用AFMIR初次获得了可能含有万古霉素铸型的形态地图（Figure 2A，B），还有具有亚微米分辨率的红外成像（Figure 2C）。采集沿肾小管的边界到沉积物的直线上的AFMIR光谱（Figure 2C，D的黄色箭头），可以得到万古霉素对这些纳米球成分的贡献。靠近沉积物时，光谱会由深蓝色变成红色（Figure 2D）。这些现象在亚微米分辨率下证实了沉积物中万古霉素的存在。

有趣的是，即使在铸型的中心，其光谱与纯万古霉素的光谱也显示出一些差异，比如在1080 cm^-1的峰信号明显增加。和在DNA中观察到的类似，该区域通常与磷酸盐（PO^2-）的对称拉伸振动或聚碳酸酯的指纹区域有关。这种差异可能是由于细胞碎片（蛋白质，肽，RNA，DNA，糖……），万古霉素和万古霉素降解产物之间复杂的聚集过程所致。使用质谱进一步鉴定这些未知共沉淀物的性质可以帮助我们探索万古霉素铸型肾病的生理病理学，并找到办法预防它。

Figure 3．使用AFM-IR来探索万古霉素铸型的异质性

万古霉素铸型的异质性可以通过利用AFMIR提供高分辨率的形态组织图来进一步说明。在第二例万古霉素铸型肾病中，沉积物不仅有常出现在腔内的球形物质（Figure 3A，蓝色和绿色框内），而且还出现了小的方形晶体（Figure 3A，红色框内）。局部红外光谱证实了万古霉素与有机碎片的混合，并基于1200-1000 cm^-1之间的非晶态碳酸盐磷酸钙的特征吸收（1060 cm^-1处的P-O条带），将晶体鉴定为磷酸钙磷灰石（Figure 3B）。这些无机物可能会在万古霉素铸型中起催化作用。由于尿碱pH和尿液浓度是导致尿磷酸钙磷灰石沉淀的最主要的原因，因此未来应该在人/动物研究中对这一点进行监测。

结语

Ariane Deniset-Besseau教授团队使用AFMIR，能够以纳米分辨率鉴定万古霉素沉积物。因为分辨率很高，作者得出了万古霉素铸型不仅由纯万古霉素组成，还含有富含磷酸盐的有机材料，并且在受损小管腔内可以发现无机纳米晶体。从内源性蛋白质背景中分离万古霉素的光谱是一项挑战，但作者可以鉴定出其酰胺键的微小修饰。这表明，该方法具有很大的潜力，可以衍生到药物诱发的肾炎、纳米晶、局部脂质或碳水化合物改变的检测等诸多应用。

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