作者：苏打水

导读：

近日，中国科学院的张华教授团队报道在J. Hazard. Mater.中发表论文，报道一种结合 CRISPR/Cas12a 和环介导等温扩增 (LAMP) 的便携式生物传感器，用于现场快速检测 抗生素抗性基因（ARG），为快速评估废水中的ARG 丰度提供了一种潜在的方法。

Portable biosensor combining CRISPR/Cas12a and loop-mediated isothermal amplification for antibiotic resistance gene ermB in wastewater

K. Mao, H. Zhang, F. Ran, H. Cao, R. Feng, W. Du, X. Li, Z. Yang,J. Hazard. Mater.2024,462, 132793. Doi:10.1016/j.jhazmat.2023.132793

正文：

抗生素抗性基因（ARG）是广泛存在的污染物，对环境和公众健康构成严重威胁，尤其是废水中的ARG是环境中ARG的重要来源。因此，监测和评估废水中的 ARG 丰度对于环境管理具有重要意义^[1]。

这里，中国科学院的张华教授团队将LAMP与CRISPR/Cas12a^[2]结合，建立了用于检测大环内酯类抗性基因ermB的便携式视觉平台，首先设计了LAMP的6个引物和CRISPR/Cas12a的crRNA，用LAMP进行预扩增，并通过碱基配对引导Cas12a识别ermB。由于CRISPR/Cas12a在扩增子识别后具有反式切割活性，使用报告分子修饰的ssDNA探针通过侧流试纸条和荧光进行可视化检测^[3]。经过磁珠简单的核酸提取后，所构建的生物传感器具有优异的灵敏度和选择性，使用荧光和废水中的流条可以低至2.75 × 10³copies/μL，实现了快速、灵敏的可视化现场检测。

如Fig.1a所示，该生物传感器的检测过程包括以下步骤：过滤和裂解预处理、磁珠提取、LAMP预扩增、CRISPR/Cas12a系统识别和转导、荧光和横向检测。作者首先设计了针对ermB基因的 LAMP 引物，接下来，设计了Cas12 crRNA来特异性识别和检测LAMP预扩增的ermB基因。以一段crRNA为指导RNA，Cas12a可以识别与crRNA识别片段互补的ermB片段。目标序列被识别后，其对 ssDNA 探针进行非特异性切割的反式切割活性被激活。之后，设计了用荧光和相应的猝灭剂修饰的单链DNA探针(5′−6-FAM-TTATT-BHQ1–3′)和用荧光和生物素分子修饰的单链DNA探针(5′−6 -FAM-TTATTATT-Biotin-3′) 分别用于荧光和侧流装置中的可视化检测。

在荧光检测中，在 Cas12a 反式切割存在的情况下，ssDNA 荧光探针解离，释放猝灭剂以恢复荧光信号。结果可以通过荧光读数装置或特定光源激发来直观地读取（Fig. 1b）。相反，在没有靶标的情况下，由于缺少激活的Cas12a，ssDNA探针不会被切割, 因此，没有产生荧光信号。

在可视化的侧流检测中，侧流探针的每一侧都用 FAM 和生物素进行了预修饰。比色侧流试纸条通常由带有 gt 抗 FAM 抗体修饰的金纳米颗粒(AuNP) 的样品垫、一条用链霉亲和素标记以捕获生物素的对照线和一条带有标记的抗 gt 抗体以捕获 gt 抗体的测试线组成。如果没有特异性的 LAMP 产物，ssDNA 探针保持完整，并且由于生物素和链霉亲和素的结合，AuNP 可以固定到对照线上，导致红色沉积。相反，AuNPs 复合物通过 AuNPs 和生物素的分离以及 gt 抗体与抗 gt 抗体的结合而固定在测试线上，形成红色条带。

为了评估LAMP在检测ermB基因时的灵敏度，将PCR扩增产生的目标DNA片段以10倍梯度稀释。结果Fig. 2所示，荧光 LAMP 成功检测到 ARGermB，LOD 为 2.75 × 10³copies/μL。DNA浓度与循环阈值时间（CT）之间存在良好的线性关系，线性范围跨越8个数量级，最高可达2.75×10¹⁰copies/μL。

为了进一步提高分析方法的特异性，研究人员将CRISPR/Cas12a系统引入检测中，以解决潜在的假阳性问题并提高灵敏度（Fig 3. a, b）。接着，为了满足复杂现场条件下可视化的各种可能要求，使用荧光和侧流试纸进行可视化检测分析(Fig 3. c, d)。

之后，为了验证构建的基于CRISPR/Cas12a的视觉平台的准确性和可靠性，对原废水进行了现场检测（Fig. 4）。结果表明，构建的CRISPR/Cas12a可视化平台能够实现废水中ARGs的快速现场检测。

总结：中国科学院的张华教授团队开发了一种基于 CRISPR/Cas12a 的便携式可视化生物传感器，用于快速现场检测和评估废水中的 ARG。从取样到出结果的检测过程在2小时内完成，不需要复杂的仪器。该方法成功克服了LAMP的假阳性问题，同时能够目视检测废水中低于2.75 × 10³copies/μL的ARG ermB，可作为废水定性和相对定量分析的有效工具。

参考文献：

• [1] Z. Han, Y. Zhang, W. An, J. Lu, J. Hu, M. Yang,Water Res.2020,183, 116088. Doi:10.1016/j.watres.2020.116088
• [2] J. S. Gootenberg, O. O. Abudayyeh, J. W. Lee, P. Essletzbichler, A. J. Dy, J. Joung, V. Verdine, N. Donghia, N. M. Daringer, C. A. Freije, C. Myhrvold, R. P. Bhattacharyya, J. Livny, A. Regev, E. V. Koonin, D. T. Hung, P. C. Sabeti, J. J. Collins, F. Zhang,Science2017,356, 438-442. Doi:10.1126/science.aaq0179
• [3] F. Hu, Y. Liu, S. Zhao, Z. Zhang, X. Li, N. Peng, Z. Jiang,Biosens. Bioelectron.2022,202, 113994. Doi:10.1016/j.bios.2022.113994

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